非小细胞肺癌传统化疗药物疗效及毒性预测 (1)

　　化疗是非小细胞肺癌(NSCLC)综合治疗的主要方法之一。由于肿瘤细胞基因的多样性导致肿瘤细胞的异质性，不同个体，不同种族的肿瘤细胞的生物学特性差异较大，对抗癌药物的敏感性有明显的差异，以致经验性化疗效果尚不理想。因此，根据化疗药物敏感基因检测，选择确定对个体的敏感性药物，可以减少化疗的盲目性避免无效药物对机体的损害，是提高NSCLC患者疗效的有效途径之一。
　　1　紫杉类药物相关敏感基因
　　紫杉醇是紫杉类植物中分离出的天然产品，主要靶点是微管，阻止微管正常生理聚集，抑制癌细胞的有丝分裂和纺锤体的形成，进而阻碍癌细胞的增生，使癌细胞的复制受阻而凋亡。目前认为，β- tubulin Ⅲ、PLK1与紫杉类耐药有关。
　　1. 1　β - tubulin Ⅲ
　　微管相关蛋白β- tubulin有7种异构体，Verdier Pinard等[1]用等电点聚焦和质谱仪联合检测发现，在7种异构体中只有β- tubulin Ⅲ才是微管作用药物耐药的唯一标志物。β- tubulin Ⅲ的突变可导致紫杉醇的耐药。对47例接受紫杉醇方案的NSCLC病人进行研究发现，β- tubulin Ⅲ的表达与患者的预后相关，其中低表达者的有效率为61. 9% ，总生存期为525天，而高表达者有效率仅为12. 5% ，总生存期仅为206天( P = 0. 0023)[ 2]。Rosell等[3]用定量PCR法检测28例应用紫杉/卡铂方案进行化疗的NSCLC患者石蜡组织中β- tubulin Ⅲ mRNA的表达，研究发现其表达与疾病进展时间也密切相关，15例β - tubulin Ⅲ低表达者疾病进展时间为6. 8个月，高表达者为4. 2个月( P = 0. 03) 。
　　1. 2　PLK1
　　PLK1 (polo - like kinase 1)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，表达仅限于着丝粒和有丝分裂中期的细胞。故在有丝分裂指数高的细胞，比如肿瘤细胞，均能检测到PLK的高表达，许多调节细胞周期的重要分子如p53，Cdc25C，Cyclin B等都是PLK的作用底物[4]。
　　Wolf G[5]研究了111例NSCLC的病人发现，PLK的低表达的患者五年生存率为51. 8% ，高表达的患者五年生存率仅为24. 2% ( P = 0. 001) 。
　　2　铂类药物相关敏感基因
　　铂类药进入肿瘤细胞后与DNA结合，形成Pt - DNA加合物，导致DNA链间或链内交联，引起DNA复制障碍，从而抑制肿瘤细胞分裂，诱导细胞凋亡。肿瘤细胞对铂类药抵抗主要涉及以下几个方面：①药物转运：包括肺耐药相关蛋白( lung resistance - related protein，LRP) 等；②药物代谢：包括谷光甘肽- S - 转移酶( glutathione - S - transferase，GST)、亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetet rahydrofolate reductase ，MTHFR)等；③药物作用靶点：如DNA；④药物转运相关基因，如Lrp等；⑤细胞凋亡。
　　DNA修复方式至少有4中，分别为：碱基切除修复（base excision repair，BER）、核苷酸切除修复（nucleotide excision repair，N ER）、错配切除修复（mismatch repair，MMR）、双链切除修复（double strand break repair）。其中对前两种DNA损伤修复基因研究较多。
　　2. 1　X线修复交叉互补基因( X - ray repair cross一complementing gene，XRCC1)
　　XRCC1是第一个从哺乳动物细胞中分离出来的对电离辐射敏感的基因，位于19q13. 2，是BER 的重要组分。XRCC1缺陷的细胞对DNA损伤敏感，单链断裂增加、姊妹染色体互换率( SCE)比正常细胞高10倍多。Wang等[6]研究了105例以DDP /CBP为主进行化疗的NSCLC患者的XRCC1 Arg194Trp 和Arg399Gln的多态性发现，携带至少一个194Trp等位基因者化疗有效率为43. 1% ，显著高于携带194Arg/Arg基因型的20. 3% (OR = 2. 97，95%CI = 1. 15 - 7. 72，P < 0. 05) 。携带XRCC1 399Arg/Arg基因型者化疗有效率为41. 5% ，显著高于携带至少一个399 Gln等位基因者的21. 2% (OR = 2. 65，95% CI = 1. 03 - 6. 87，P< 0. 05) 。并且这两个多态之间存在联合作用，同时携带194Arg/Trp和399Arg/Arg基因型的患者，化疗效果进一步提高。
　　高长明[7]等人收集经病理学确诊的NSCLC 57 例，用PCR-RFL P 技术检测XRCC1 194 和399 基因型。所有患者均经PDD/ GEM 化疗方案治疗。XRCC1194 Trp/ Trp 、Tp/ Arg 和Arg/ Arg 基因型者的化疗有效率分别为50. 0 %、52. 2 %和16. 7 %。携带Trp 等位基因者的化疗有效率(51. 9 %) 显著高于Arg/ Arg 基因型者(χ2 = 6. 41，P = 0. 0113) ；XRCC1 399 Arg/ Arg 、Arg/ Gln 和Gln/ Gln 基因型者的化疗有效率分别为35. 5 %、34. 8 %和0 ，各组间的差异无显著性。XRCC1 194 与XRCC1 399 多态之间在化疗敏感性方面存在明显的交互作用，同时携带194 Arg/ Arg 和399 Arg/ Arg 基因型者的化疗有效率仅为7. 7 %(1/ 13) ，而同时携带XRCC1 194 Trp 等位基因和399Arg/ Arg 基因型者的化疗有效率为58. 8 %(10/ 17) ，2 组之间差异显著(Fisher’s 双侧检验： P = 0. 0067) 。
　　2. 2　核酸切除修复( nucleotide excision repair，NER)
　　NER是细胞修复损伤DNA的重要机制，可以修复多种类型的DNA损伤。整个NER修复系统非常庞大，有近30个基因产物参与整个过程。NER分为转录互补修复( TCR)和全基因组修复(GGR) 。TCR修复活性基因DNA转录链中转录阻滞的基因，GGR修复活性基因DNA非转录链中损伤的基因。
　　2. 2. 1　切除修复交叉互补基因( excision repair cross complementing 1，ERCC1) 　
　　ERCC1 是NER 的组成成分，参与DNA损伤识别和DNA链的切割。ERCC1mRNA表达水平与不同组织的DRC有关，ERCC1mRNA 的过度表达在Gem /DDP治疗中预后差[8]。
　　Ryu JS[9]分析了109 例以铂类为基础进行化疗的NSCLC病人ERCC1第118位密码子的多态性时发现，具有C /C基因型患者为54例，他们的中位生存期长(486天) ，而变异型C/T或者T/T的患者为53例，他们的中位生存期短(281天) ，两者具有明显差异( P = 0. 0058) 。这提高了ER2CC1第118位密码子具有C/C基因型的患者对铂类药物敏感预后价值。
　　Reginald V. N. Lord[10]等运用RT - PCR方法研究了56例晚期NSCLC的病人，发现在应用铂类为基础的化疗下，ERCC1低表达的病人中位生存期为61. 6周，而ERCC1高表达的病人中位生存期为20. 4周，明显低于ERCC1低表达的病人( P = 0. 046) 。
　　此外，2006年，Olaussen KA[11]在N Engl J Med上发表了关于NSCLC病人ERCC1表达水平预测铂类疗效的大样本研究，应用了免疫组化的方法研究了761位NSCLC的病人的ERCC1的表达水平，有335 (44% )例表达阳性，426 (56% )例表达阴性，在应用顺铂为基础的辅助化疗下，表达阴性的病人的总生存期明显高于表达阳性的病人( P = 0. 002) 。这是NSCLC个体化疗里程碑式的文章，表明NSCLC个体化疗走向成熟。
这些大样本的研究结果显示了ERCC1 在临床上指导NSCLC铂类用药的重要价值。
　　2. 2. 2　乳腺癌基因1 ( Breast cancer 1，BRCA1)
　　BRCA1是在DNA修复中起重要作用的一个基因，曾有研究显示低表达的BRCA1在乳腺癌中呈现对铂类药物的高敏感，2004年Miquel Taron，Rafael Rosel等人[12]研究了BRCA1表达与肺癌的关系，共研究了55例手术切除后接受健择/顺铂方案化疗的NSCLC患者的BRCA1mRNA的表达水平，结果显示了两个cut - off值，BRCA1mRNA值小于0. 61的病人有15例预后最好，中位生存期未达到；大于2. 45的病人有12例，预后最差，中位生存期为12. 7个月；中间值的病人有28例，中位生存期为37. 8个月( P = 0. 01) 。且BRCA1mRNA低表达的病人的死亡风险明显低于高表达的病人( P = 0. 026) 。2006年ASCO 会议报道，BRCA1的表达水平可以作为两种化疗药物的预测分子：BRCA1 mRNA水平低，对于接受铂类药物治疗的患者有生存优势，对于紫杉类药物的预测作用正好相反[13]。
　　2. 2. 3　着色性干皮病基因D( xeroderma pigmentatosum D，XPD) 　
　　XPD 也称作ERCC2 基因，位于染色体19q13. 2 -19q13.3，是通用转录因子RNA聚合酶Ⅱ ( TFⅡH )组分之一，负责NER系统中5’- 3解’旋酶活性，参与TCR和GGR两条NER修复途径，在DNA损伤修复中发挥重要作用[14]。其中，XPD Asp312Asn和Lys751Gln的多态性被认为XPD功能改变有关[15]。
　　2004年Massachusetts General Hospital与Harvard Schoolof Public Health[16]共同研究了103例接受含铂方案化疗的NSCLC病人XPD312 密码子的SNP，发现XPD312 Asp /Asp基因型的总生存期为16. 3个月，Asp /Asn基因型为15. 2个月，Asn /Asn基因型为6. 6个月( P = 0. 003) 。同时，XRCC1399密码子SNP与总生存期也具有相关性，野生型Arg/Arg的总生存期为17. 3个月，杂合子Arg/Gln为11. 4个月，变异型Gln /Gln的为7. 7 个月( P = 0. 07 ) 。并且，XPD 多态与XRCC1多态之间存在相关性，含有变异型等位基因数目越多的病人，总生存期越短( P = 0. 009) 。
　　Rosell等[17]研究了80例NSCLC患者，发现XPD 751密码子的SNP与疗效显著相关。在应用健择/顺铂方案的病人中，Lys751Gln基因型的疾病进展期为9. 6个月，Lys751Lys基因型的为4. 2个月( P = 0. 03) ；但是，在应用顺铂/长春瑞滨方案的病人中，Lys751Lys基因型的预后较好；在应用多西紫杉联合健择/顺铂方案的病人，Lys751Lys基因型的预后也较好。
　　2. 2. 4　着色性干皮病基因C( xeroderma pigmen tatosum C，XPC) 　
　　XPC在NER过程中起重要作用，其内含子9与外显子15单核苷酸连接失衡，导致氨基酸改变，与HR23B形成复合物，可能是激活NER的早期损伤识别因子[18]。与DNA修复能力相对较强的XPC SS基因型携带者相比，DNA修复能力弱的XPC LL基因型携带者对铂类药物的敏感性较高。这是由于DNA修复能力强的个体能够及时有效的修复由铂类药物攻击DNA造成的损伤而导致耐药[19]。Yuan P等[20]对200例以铂类为基础的化疗的NSCLC患者的研究发现，携带XPC LL基因型个体的化疗敏感性是SS基因型的3. 04倍( P = 0. 015) 。
　　但是，NER是一个非常复杂的过程，单一的修复基因不可能有效地完成所有的修复过程。因此在铂类药物敏感性中，DNA修复的各种基因存在一定的联合作用。
　　2.2.5   协同作用
　　袁芃[21]等人对接受含铂类药物化疗的200 例晚期NSCLC 患者进行临床疗效评价。以聚合酶链-扩增片段长度多态性( PCR-AFLP) 和限制性片段长度多态性( RFLP) 的方法检测XPC-AT、XPD Lys751Gln ( rs1052559) 和ERCC1 C8092A ( rs1052559) 多态的基因型，比较不同基因型与化疗敏感性的关系。结果： 结合疗效情况，XPC-PAT 遗传多态各基因型在化疗有效组( CR+PR) 和无效组( SD+PD) 中的分布频率差异有显著性(X2检验，P=0.023) ，携带XPC LL 基因型个体的化疗敏感性是XPC SS 基因型携带者的3.04 倍( 95% CI 为1.25～7.41，P=0.015) 。没有发现XPD Lys751Gln 和ERCC1 C8092A 多态与化疗敏感性的相关性。但联合分析后发现，核苷酸切除修复系统的这三个遗传多态在晚期NSCLC 患者对铂类药物敏感性中存在一定的联合作用( 趋势检验，P=0.021) 。结论： 核苷酸切除修复系统中XPC-PAT、XPD Lys751Gln 和ERCC1 C8092A 遗传多态可能与NSCLC 患者对铂类药物敏感性相关。
　　2. 3　谷胱甘肽- S转移酶P1( GSTP1)
　　谷胱甘肽- S转移酶家族(包括GSTA1、GSTM1、GSTT1、GSTP1 等) 参与包括抗肿瘤药物的代谢，其中GSTP1基因多态性以及异常表达与发生肿瘤的危险性及抗肿瘤疗效相关。
　　GSTP1的外显子5 ( Ile105Val)和外显子6 (Ala114Val)存在多态性，会降低GST的活性，与肺癌患者的预后相关。2006年，美国得克萨斯大学安德森肿瘤中心报道了[22]425例晚期NSCLC接受含铂方案化疗预后研究，显示外显子6的多态性，变异型(Ala /Val或者Val/Val) 与野生型(Ala /Ala)的病人的中位生存期有显著差异，分别为16. 1 个月和11. 4 个月( P = 0. 037) ，两组总生存期的差异在< 62岁者( P = 0. 020) 、男性(P = 0. 037) 以及既往吸烟者( P = 0. 032)中更为显著。但是外显子5的多态性与生存期无关。
　　2.4 亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetet rahydrofolate reductase ，MTHFR)
　　亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetet rahydrofolate reductase ，MTHFR) 是叶酸代谢的关键酶，在DNA 甲基化中起重要作用。MTHFR 基因是多态的，其中最常见的是C677 T 和A1298C 多态。前者在677 位点发生C v T 改变，后者在1298 位点发生A vC 改变，二者都影响酶的活性[23, 24]。而MTHFR 活性的高低将影响基因组DNA 的甲基化。体外研究已经证明一些基因(如细胞周期关卡基因、DNA 修复基因等) 的异常甲基化可以影响细胞毒性药物和干扰DNA合成药物的敏感性[25- 28]。MTHFR 不可逆地催化5,10-亚甲基四氢叶酸(5 ，10-MTHF) ，使其转变为5-甲基四氢叶酸，后者作为甲基供体经蛋氨酸合成酶的催化，使同型半胱氨酸转化为蛋氨酸，进而转化为S-腺苷蛋氨酸，在DNA 甲基化中起重要作用。研究表明MTHFR C677 T 变异型纯合子基因型与血浆中同型半胱氨酸水平的升高和52甲基四氢叶酸水平的降低有关[29]。体外实验也证实MTHFR C677 T 纯合子变异基因型携带者的DNA 接受甲基的能力显著高于纯合子野生基因型者的DNA[30]。说明MTHFR 基因变异导致了作为甲基供体的蛋氨酸合成障碍，进而导致了DNA 的低甲基化。细胞基因组DNA 的去甲基化可能与细胞的过度增生有关，研究证明细胞DNA 的甲基化水平、特别是有关基因表达控制点的甲基化水平对基因表达起调节作用，甲基化水平降低，相关基因的转录水平就增高。现有资料表明MTHFR 基因677C →T 突变频率在不同国家、同一国家不同地区及同一地区不同民族的分布有显著差异。欧洲人677 T 等位基因频率为22 %～44 % ，亚洲人中日本人677 T 等位基因频率为34 %，中国汉族人为40 % ，因而认为亚洲人MTHFR 基因677C →T 突变频率偏高。对1298A →C 突变频率在人群中的分布研究显示，C 等位基因频率在亚洲人为17 %～19 % ，西欧为27 %～36 %[31]。史美祺[32]等人收集经病理学确诊的中、晚期NSCLC 病例97 例。用PCR-RFL P 技术检测患者MTHFR 基因型。所有患者均经以铂类为基础的化疗方案治疗。结果　①97 例NSCLC 病例中，MTHFR C677 T C/ C、C/ T 和T/ T 基因型频度分别为34. 0 %、50. 5 %和15. 5 % ，A1298C A/A、A/ C 和C/ C 基因型频度分别为64. 6 %、29. 2 %和6. 2 %。化疗后总有效率(完全缓解+ 部分缓解) 为39. 2 %。②分别分析MTHFR C677T 多态性和A1298C 多态性与化疗疗效的关系时，未发现这两个多态与NSCLC 化疗的疗效有明显关系。而联合分析MTHFR C677T 多态性A1298C 多态基因型与化疗疗效的关系时，发现携带MTHFR C677T T 等位基因(C/ T 或T/ T 基因型) 、同时携带A1298C A/ A 基因型者的有效率为51. 1 % ，显著高于同时携带C677T C/ T 基因型及A1298C C 等位基因者(12. 5 %) ( P = 0. 007 ，OR =7. 30 ，95 % CI ： 1. 34～52. 47) 。结论　MTHFR 基因C677 T 和A1298C 多态联合作用可影响NSCLC 对化疗的敏感性，MTHFR 基因型检测对指导NSCLC 的化疗、预测疗效具有较高的临床价值。
　　2.5　药物转运相关基因- Lrp
　　L rp基因定位于染色体16p13. 1 - 16p11. 2，介导一些物质在核与胞质中双向转运，导致耐药。Izquierdo等[33]发现L rp可介导对顺铂和卡铂的耐药性，是独立预测肺癌化疗效果的危险因素。Harada 等[34]发现57 例铂类化疗的NSCLC中L rp表达与鳞癌化疗耐药明显相关，阳性和阴性组缓解率分别为33%和100% ，研究认为应用免疫组化法检测Lrp，可把鳞癌患者分为化疗敏感组和耐药组，以制定不同的化疗方案。

　　2.6　凋亡相关基因
　　目前存在2种凋亡相关通路，受许多基因调节。其中任何基因异常均可能影响化疗药的反应，如p53，K - ras等。
　　2.6.1　K - ras
　　原癌基因K - ras是一些分子下游信号途径的一部分，其突变可能导致细胞增殖失控和肿瘤发生发展。Camps[35]等报道67例晚期NSCLC患者含铂方案化疗有效率、中位TTP和总生存期与K - ras基因型无显著相关，认为K - ras突变不是晚期NSCLC 有意义的预测因子。而Micheal[36]将881例关于K - ras与NSCLC预后的资料meta分析，K - ras突变与生存期短相关。肺腺癌K - ras突变缺乏分化，恶性度高，对顺铂不敏感，预后不良。也有分析显示[37]，ras突变的I/Ⅱ期术后患者顺铂辅助化疗疗效与观察组相似(P = 0. 87) ，表明ras突变患者可不辅助化疗。K - ras突变的预后影响主要在NSCLC早期，特别是腺癌，但还存在争论。
　　2.6.2　p53和p73
　　p53及同源体p73处于铂类药引发DNA损伤- 凋亡信号转导通路的中枢地位。p53第72密码子Arg→Pro和p73第2外显子G4C14→A4T14 SNP ，与这两个重要蛋白功能改变有关[38]。研究表明，p53和p73功能紊乱与铂类敏感性有关[39]。
　　p53体细胞突变时，Arg等位基因传导凋亡信号的能力比Pro等位基因弱[38]。研究显示[40]，165例晚期NSCLC患者携带至少1个p73变异等位基因者，对铂类敏感性比携带两个p73 G4C14等位基因者高( P = 0. 019) 。重要的是，2个基因多态合并分析显示，同时携带p53和p73变异等位基因者疗效显著增高。

　　3　吉西他滨( Gemcitabine)类相关敏感基因
　　吉西他滨又名健择，为细胞周期特异性抗代谢类药物，主要作用于DNA合成期的肿瘤细胞，在一定条件下，可阻止G1 期向S期进展。相关研究显示，RRM1，hENT1以及cN -II的多态性或异常表达可能与健择的临床耐药相关。
　　3. 1　核糖核苷还原酶亚单位-1(ribonucleotide reductase subunit 1，RRM1)
　　健择的分子靶点为RRM1 ( ribonucleotide reductase subunit 1)基因，是肿瘤抑制基因，是核糖核苷还原酶( ribonucleotide reductase，RR)的亚单位1。
　　Rosell R等[41]在2004年研究了100 例以健择/顺铂方案进行化疗的NSCLC患者，发现RRM1低表达的患者的总生存期明显高于高表达的患者，分别为13. 7个月和3. 6个月( P = 0. 009) 。并且RRM1与ERCC1的表达之间存在明显的相关性( P < 0. 001) ，RRM1与ERCC1均低表达的总生存期未达到( not reached) ，RRM1与ERCC1均高表达的总生存期为6. 8个月(P = 0. 016) 。
　　P. Cepp i等[42]在2006年研究了70例以顺铂/健择为基础化疗的NSCLC患者的ERCC1与RRM1与预后的关系，发现RRM1 低表达患者总生存期明显高于高表达者，分别为13. 9个月与10. 9个月( P = 0. 039) ，并且RRM1与ERCC1均低表达( n = 33)预后更好( P = 0. 0345) ，与Rosell等的结果一致。
　　由此可见，RRM1作为健择化疗预后的基因预测指标，具有重要的临床应用价值。
　　3. 2　平衡型核苷转运载体1 ( human equilibrative nucleoside transporter 1，hENT1)
　　Achiwa H[43]等通过定量逆转录聚合酶链反应( reverse transcription - polymerase chain raction，RT - PCR ) 检验人hENT1在NSCLC细胞系中的表达水平，来研究其对健择敏感以及耐药的关系。研究结果显示，在对健择敏感的细胞系中，出现了hENT1的表达上调，因此，hENT1的表达上调意味着对健择敏感。Spratlin J 等[44]研究了21例接受健择方案化疗的NSCLC病人，hENT1表达的病人总生存期更长，为13个月，而hENT1 缺失的病人的总生存期为4 个月( P =0. 01) 。与体外的研究结果一致。
　　3. 3　cN - II
　　Pascal等[45]研究了43例接受健择化疗的NSCLC病人，其中36例cN - II表达阳性(86% ) ，并且cN - II低表达的患者总生存期较高表达的患者短，分别为6个月和11个月( P= 0. 047) 。此外，cN - II与dCK的表达水平也呈相关性( P< 0. 00001) 。
　　这一研究结果显示了cN - II的表达水平与接受健择化疗的NSCLC病人的预后相关。但是其机理尚未明确，可能与内源性的核苷池的调整有关[46]。
　　肺癌化疗耐药已成为不容忽视的难题摆在我们面前。耐药问题的解决必将对提高肿瘤患者治疗效果，延长生存有重大影响。但耐药是个复杂的过程，由多种基因、多种机制共同参与作用。所以这项工作意义重大，但任重而道远。

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