乳腺癌患者循环肿瘤细胞的检测及其临床应用

乳腺癌患者循环肿瘤细胞的检测及其临床应用
苏州大学附属第一医院肿瘤科　陶　敏　李　燕　李大鹏　马德亮

　　肿瘤转移是乳腺癌治疗失败的主要原因。肿瘤细胞进入外周血是发生远处转移的前提，早在1896年，Ashworth在1例因癌症死亡的患者外周血中发现了类似肿瘤的细胞，并首次提出了循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)的概念。进入循环未被清除的肿瘤细胞可相互聚集形成微小癌栓，并在一定条件下发展为转移灶，越来越多的学者开始关注循环肿瘤细胞方面的研究，近年来，有关乳腺癌患者CTC检测及其临床应用的研究取得了长足的进展。
　　一、CTC的检测方法
　　应用于CTC检测的方法较多，通常分为初步筛选富集CTC和确认CTC两个阶段。前者主要应用一些物理化学原理进行筛选，后者主要依靠肿瘤细胞上存在的一些肿瘤特异性或器官特异性标记以及肿瘤细胞本身的形态学特征等进行确认。合理选择两个阶段的不同方法并加以有效结合，可以寻找出敏感性和特异性均较高的方法。
　　(一)　初步筛选和富集肿瘤细胞方法
　　1、免疫磁性分离技术(IMS immunomagnetic separation)
　　这种方法主要利用免疫磁珠既能结合活性蛋白质(抗体)，又能被磁铁所吸引的特性，依靠被分离细胞上抗原与包被磁珠的抗体的特异性反应形成抗原-抗体-磁珠免疫复合物，随后利用磁场使与磁珠结合的细胞因磁力作用而发生力学移动，从而与其他细胞分离。近年来，以纳米技术制造的磁珠大小达到了纳米级(10~100nm)，用其分选细胞的方法具有高特异性、高浓缩性、高分离率、且不影响细胞活性等特点，能从大量细胞中筛选出带有特异性标记的极少量细胞。许多研究者将该法用于外周肿瘤细胞的富集分离，可对肿瘤细胞进行104~2×105倍的富集，大大提高了外周血样本中肿瘤细胞的浓度，从而提高了检测的敏感性。
　　近年研究建立的细胞检测体系(CellSearch System)特异性强、敏感性高。该检测体系应用特异上皮细胞标记富集细胞，被富集的细胞随后用细胞核染料DAPI染色，并用带不同荧光的粒细胞特异抗体标记CD45进行阴性选择和上皮特异抗体EpCAM(表皮细胞黏附分子)和cytokeratins(细胞角蛋白)8、18或19染色进行阳性选择，从而分离出肿瘤上皮细胞(CD45-, EpCAM+ and cytokeratins 8, 18+ and/or 19+)，然后用半自动荧光显微镜检测并重建图像供分析。这种细胞检测体系已被美国PDA批准用于监测乳乳腺癌预后和治疗效果。
　　2、密度梯度离心法
　　指根据血液中的各种细胞的密度不同，利用一种特定密度且近于等渗的溶液(分层液)与标本加入同一试管后离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将血液中的各种细胞加以分离。在此基础上建立起来的OncoQuick方法用一种专用的50ml的试管，内置多孔屏障，其下为密度梯度分离液，使用时将标本置于屏障之上从而避免在离心之前与分离液混合，与单纯密度梯度离心法相比，更易从粒细胞中分离出肿瘤细胞，从而更有利于细胞染色、免疫标记、分子生物学分析进一步的分析。该方法的局限性在于由于部分肿瘤细胞可迁至血浆层或与留于红细胞或中性粒细胞中，因而在分离过程中可能丢失少量CTC，其敏感性较低且依赖于肿瘤细胞的特性、离心的时间、温度等多种因素，在对比分析研究中发现，该方法的敏感性低于之前的CellSearch System。
　　3、膜滤过法
　　该方法分离也称为ISET(Isolation by Size of Epithelial Tumor cells)，依据上皮肿瘤细胞的大小进行分离。研究表明绝大多数的外周粒细胞(淋巴细胞和中性粒细胞)是体内最小的细胞，其直径约为8~11um，它们中绝大部分能从8um孔径的聚碳酸酯膜滤过从而被清除，而直径大于11um的细胞(包括肿瘤细胞、上皮细胞)则留于膜的表面。有研究者用多种不同孔径的膜进行对比研究，结果显示用8um大小孔径的膜分离外周血肿瘤细胞效果最佳。运用该方法的关键在于避免在多个步骤的分离过程中丢失细胞。一般用多个分离区域分别过滤，每个区域均滤过1ml的血标本，以便于精确的计算每毫升中的CTC数量。该法分离所得的细胞可用于细胞染色、免疫标记、FISH、TUNEL(细胞凋亡检测)及分子生物学分析。还可用于检测和计数其它方法均无法检测的CTM(circulating tumor microemboli，循环肿瘤微栓子)。该方法具有敏感，简便、价廉、不破坏细胞等优势，具有较好的运用价值。有重复实验表明如用微量吸管进行操作，该方法可以分离出1ml血中一个肿瘤细胞。
　　(二)　识别和确认CTC的方法
　　1、免疫细胞化学方法(immunocytochemistry，ICC)
　　其基本原理是抗原抗体结合反应，利用单克隆抗体与肿瘤标志物相关蛋白或相关抗原结合，并通过酶和底物反应显色或其他显色方法来判断肿瘤细胞的存在，其敏感性为105~106，该方法比较简便、直观。由于目前尚无能代表CTC特征的特异性抗原(即在所有被分离的肿瘤细胞上表达、而不在粒细胞和其它分离到的非肿瘤性上皮细胞上表达的抗原)，故多用上皮特异抗原来分离CTC，常用的肿瘤标志物有EpCAM、CK(cytokeratin细胞角质素)等，EpCAM和CK广泛表达于正常上皮细胞和上皮性肿瘤细胞，而正常情况下淋巴结、血液及骨髓中不产生EpCAM和CK。上皮特异能标记非肿瘤上皮细胞而导致假阳性，有报道CK在正常对照组中阳性率达0~20%。器官特异性标记也可被用于进一步证实CTC，乳腺癌中常用的主要为乳腺球蛋白(mammoglobulin)，HER-2等，但是由于这些标记并非在所有肿瘤细胞上表达，甚至也并非完全的器官特异性，因而也会导致假阳性或假阴性。为提高检测敏感性和特异性，已有研究者用多种标记联合检测CTC。
　　2、逆转录聚合酶链式反应(reverse-transcriptase PCR，RT-PCR)
　　该方法的基本原理是通过引物扩增并检测特异性mRNA(肿瘤细胞标志性基因或靶mRNA)来证实肿瘤细胞的存在。RT-PCR具有高效率、高灵敏度、高特异性的优点，是检测CTC的比较有效的方法，可以鉴别出106~107正常细胞(相当于0.1~1ml血)中一个靶细胞。其不足之处在于CTC已被破坏，无法进行形态学观察、无法进行计数和对个别细胞进行分析等，另外取样时上皮细胞污染、肿瘤标志物在外周血的非正常表达及假基因干扰等原因可导致假阳性结果，故要求有严格的阴性对照来证明PCR信号的阳性率。该方法的另一缺陷是目前仍未找到符合要求的高表达高特异性的乳腺癌标志物。目前较常用的肿瘤标志物有：(1) 组织特异性标志物mRNA，如CK19、CK20、hMAM(human mammaglo-bin)等；(2) 乳腺癌特异性标志物mRNA，如CEA、MUC1、HER-2、MAGE-A3等。其中，CK19、CK20和hMAM是目前文献报道RT-PCR中应用最多的标志物。
　　近几年在RT-PCR的基础上发展而来的巢式RT-PCR(nested RT-PCR)、实时定量RT-PCR(real time quantitative RT-PCR)等新技术，可进一步提高检测的灵敏度、特异性，其中实时定量RT-PCR技术在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，可对起始模板进行定量分析，弥补了RT-PCR的部分不足。由于单个标记检测可能会导致较高的假阴性，近年运用多种标记进行联合检测的研究增多，结果显示多标志联合检测可明显提高检出率。
　　3、流式细胞术(flow cytometry, FCM)
　　流式细胞术是运用标记荧光物质的单克隆抗体与肿瘤细胞特异性的标志物结合，使肿瘤细胞染色，然后用流式细胞仪进行测量分析。FCM可以进行多参数测量，实验表明多参数FCM可以显著提高检测的敏感性。运用MACS(磁化细胞分离)技术富集肿瘤细胞后再进行FCM检测也可以提高敏感性。MACS-FCM可以检测到1ml外周血中的1个肿瘤细胞。FCM检测快速、准确，可以定量检测乳腺癌病人外周血中肿瘤细胞的含量。但FCM不能提供有关癌细胞形态方面的信息，也无法对CTC进行进一步的分析。
　　4、激光扫描细胞计量技术(Laser Scanning Cytometry, LSC)
　　LSC是八十年代迅速发展起来的高通量细胞分析仪。LSC具有流式细胞仪和图像细胞仪的功能，可通过连续扫描荧光显微镜下图像自动分析产生数据的新方法，可在一定时间(0.5~1小时)内在显微镜下自动筛查5×104个细胞，如与浓聚细胞技术相结合，经过荧光染色后可达到在107个细胞中发现1~2个肿瘤细胞的敏感性。由于背景等原因无法用流式细胞仪分析的样本也可用LSC进行细胞定量检测。最关键的是LSC能通过目镜直接观察细胞及细胞核形态，且LSC显微镜光学系统以激光为光源，具有普通光学显微镜无法相比的高灵敏度、高分辨率、高放大倍数的特性，可对细胞内微细结构进行定性、定量、和定位分析。Pachmann等首次将LSC运用于外周血少量肿瘤细胞的检测，并用一系列对照实验研究建立了标准化操作规程。目前将用LSC进行分析，能对细胞进行重新定位后用直接观察、定量并拍摄荧光照片的分析过程称为MAINTRAC分析。
　　二、CTC检测的临床应用
　　近年来发现乳腺癌循环肿瘤细胞检测在诊断、治疗、评估疗效及提示预后等多方面具有重要的临床意义。目前对于乳腺癌CTCs的研究主要包括以下几方面：
　　(一)　CTC检测与诊断
　　CTC的特征与原发肿瘤的特征基本一致，用于CTC检测的外周血标本较易采集，因此，对部分病理类型及肿瘤基因型和表型特征不明的患者可利用对CTC的检测来协助诊断。Reinholz等进行了一项用CTC的分子生物学特征来早期诊断乳腺癌的研究，对无肿瘤病史，摄片发现乳腺异常而进行活检确诊的患者，用密度梯度离心法和免疫磁性分离法联合实时定量RT-PCR定量检测四种乳腺特异性基因：乳腺球蛋白、GABA A(pi)、B305D-C和B726P的表达水平，结果发现乳腺免疫球蛋白或B305D-C诊断乳腺癌的敏感性和特异性分别达到70.5%和81.0%，因而认为用CTC的分子生物学特征标志如mammaglobin和B305D-C的表达水平对乳腺癌的早期诊断有潜在价值。但由于CTC数量较少，故无法用于肿瘤筛查及早期发现。
　　(二)　CTC检测与临床分期
　　CTC的检测可能可以进一步完善肿瘤的分期。有研究显示，乳腺癌患者CTC数量与临床分期有关，III-IV期患者的CTC数量显著高于I-II患者；当CTC数量大于某界值时，发生远处转移的可能性将明显增高；对于转移性乳腺癌，CTC可用于独立评价肿瘤负荷；肿瘤的表型特征也可能成为判断乳腺癌生物学行为的重要标记。因而CTC的检测可能成为乳腺癌患者分期的新参考标志。
　　(三)　CTC检测与个体化治疗
　　1、术后CTC检测的意义
　　手术可能会引起CTC的一系列规律性变化，可能对微转移有一定的促进作用，因而对术后CTC的监测(即使是早期患者)也很重要，对及时发现和预防远处转移有一定的意义。Camara等用MAINTRAC分析方法检测乳腺癌患者手术前、术后30分钟、60分钟、3天及7天外周血中循环上皮细胞的变化，结果发现循环上皮细胞在术后30分钟、60分钟没有立即变化，在术后3~4天有85%的患者(所有患者肿瘤均完全切除)升至原来的1000倍，随后循环上皮细胞数量出现下降，但是有58%的患者下降至手术前水平以上直至开始化疗，在部分未予进一步治疗或仅予内分泌治疗的低危患者，持续三年监测循环上皮细胞水平发现数量多持续升高没有下降或仅有轻微下降，表明该部分患者外周血中肿瘤细胞可能长期存在，这些细胞有可能持续处于休眠状态但有可能在合适的条件下聚集并发展为转移灶。
　　2、CTC检测对化疗效果评估的意义
　　对乳腺癌患者CTC检测的意义一般包括对新辅助化疗、辅助化疗的疗效评估及长期的随访监测。CTCs的常规监测可被用作及时评估化疗疗效以便适时改换治疗方案，这可减少患者遭受不必要的毒副反应并使患者及早接受最佳的治疗方案；此外，通过对CTC的随访监测可早期发现肿瘤进展，指导临床医师采取必要的治疗措施。
　　传统新辅助化疗的疗效评估主要依赖化疗引起的原发肿瘤的大小的变化。对乳腺癌新辅助化疗患者的CTC研究显示，CTC的变化与原发肿瘤对化疗的反应是一致，CTC可被认为是肿瘤的一部分并且也可用于监测新辅助化疗的疗效，而且在化疗的第一周期就可以发现CTC的变化，这对临床医师及时选择合理的治疗措施有重要意义。
　　术后辅助化疗在乳腺癌的综合治疗中已广泛应用，其治疗的临床意义在于杀灭微转移灶，降低转移和复发，提高治愈率和生存率。然而，辅助化疗没有及时有效的疗效评估方法，通常一个化疗方案需要经过临床试验在几年后经统计学分析才能确定其疗效，而且由于个体差异的存在，无法知道这个方案对不同个体是否有效，可能让患者遭受不必要的化疗毒性。Pachmann等通过连续检测循环上皮肿瘤细胞(CETC)来监测对辅助化疗的反应，在治疗前、每个化疗周期前和化疗结束之后检测CETCs的数量，观察到3种典型反应：(1) 细胞数量下降(大于10倍)；(2) 细胞数量边缘变化(小于10倍)；(3) 细胞数量增高或者起初下降后来升高(大于10倍)。结果发现22%的患者在40月后发生复发，包括第一种反应的28名患者中1位，第二种反应的30位患者中5位，第三种反应中33位患者中14位；辅助化疗后CETC细胞数量增高大于10倍患者的无复发生存时间显著短于CETC细胞数量下降大于10倍的患者。提示CETC检测能及时判断辅助化疗的效果，并可根据疗效预测预后，早期发现可能复发的患者。
　　对于晚期/转移性乳腺癌，CTC检测较影像学检查能更早的判断患者的化疗效果，传统的化疗效果是通过影像检查根据肿瘤大小在开始治疗后的2~3个月方能判断，而根据CTC检测可在治疗开始后3~4周预测疗效。Nolé等用CellSearch System方法检测80名晚期乳腺癌患者CTC变化情况，在治疗前和开始治疗后4周、8周、此后每隔两月进行临床评价，结果发现治疗前后CTC数量下降明显者，其进展风险明显低于无明显变化者，提示CTC数量变化可评估疗效进而提示预后。
　　3、CTC检测对分子靶向等生物治疗效果评估的意义
　　CTC是原发肿瘤的代表，研究表明CTCs从基因型和表型上都能忠实的代表原发肿瘤的情况。对某些原发肿瘤分子生物学特征不明确的患者，可通过对CTC的相关检测使某些因无相关证据而不能进行靶向治疗的患者得到治疗的机会。Fehm等用血清HER2水平和CTC来测定原发肿瘤HER-2阴性或不详的复发的77例乳腺癌患者的HER-2的状态。结果发现77例患者中有23例至少用一种方法检测出HER-2阳性，两种方法检测结果相一致的为21例中的15例(71%)。在Her2常规检测阴性而CTC检测阳性的患者中，使用曲妥珠单抗治疗仍可取得疗效，提示可用这两种方法进行HER-2的评估，从而使这些本来无法进行HER-2的靶向治疗的患者获得靶向治疗的依据。另外，可根据乳腺癌患者CTC表面分子特征选择合适的分子靶向治疗，并可通过CTC数量的检测判断疗效。如根据CTC是否表达EGFR选择是否应用抗EGFR治疗，根据HER-2阳性CTC的数量变化判断HER-2疫苗治疗的效果。
　　4、CTC检测与预后评价
　　研究表明，不论是早期或晚期乳腺癌，检测CTC均能在一定程度上提示预后。CTCs的数量增加能够提示早期无转移乳腺癌的不良预后和进展期乳腺癌的生存期缩短。Cristofanilli等研究发现，177名转移性乳腺癌患者中，治疗前外周血>5CTCs/7.5ml患者的无进展生存(PFS)和总生存(OS)期较短，多因素分析显示治疗前的CTC数量是独立的预后因素；同时该研究发现初次治疗后随访CTC的数量可有效预测治疗效果，较影像学检查能更早的判断化疗效果。两年后，Hayes等对177名MBC患者继续随访并将所有患者分成4组，评估PFS和OS情况：(1) 在所有的检测外周血<5CTCs/7.5ml，(2) 治疗前外周血≥5CTCs/7.5ml和治疗后末次检测外周血<5CTCs/7.5ml；(3) 治疗前外周血<5CTCs/7.5ml和治疗后末次检测外周血≥5CTCs/7.5ml；(4) 全部检测结果均≥5CTCs/7.5ml。第4种检测结果的患者中位PFS和OS较得到其它任何检测结果的患者为最短。治疗前CTC大于等于5个治疗后小于5个的患者显示其PFS和OS与那些CTC从未升高的患者相当，治疗前后CTC从小于5个升至大于等于5个的患者与CTC保持低水平的患者相比其总生存缩短，但比CTC始终大于5个的患者长，结果均有统计意义。鉴于此，该方法目前获FDA批准CTC检测用于临床。以上表明在晚期乳腺癌患者，CTCs数量变化可用于评估临床疗效并进而提示预后。
　　三、小结与展望
　　大量实验已经证实CTC检测将有助于乳腺癌早期诊断、复发转移监控、判断患者预后、指导术后辅助治疗等。与淋巴结、骨髓相比，外周血标本易获得、创伤性小、可反复采集，是临床上常规检测较为理想的标本来源。但CTC的临床应用也存在一些问题：目前多用上皮特异抗原来代替肿瘤细胞特异抗原，如何进一步探索寻找更适合的肿瘤细胞标记仍将是今后研究的重点。目前CTC的研究多集中在CTC数量分析上，有学者开始关注CTC本身的差别。如CTC表面的蛋白表达或其基因突变与临床的关系。同时，由于CTC是肿瘤转移的关键的阶段，CTC的研究还为肿瘤转移、肿瘤免疫逃避及化疗耐药等提供了重要的研究对象。
参　考　文　献
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