非小细胞肺癌个体性化疗：从临床前到临床研究的启示

非小细胞肺癌个体性化疗：从临床前到临床研究的启示
暨南大学附属第一医院肿瘤科　　徐　萌

　　肺癌是人类发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，以铂类药物为基础的联合化疗是中晚期肺癌一线治疗的金标准，在过去三十年中非小细胞肺癌的中位生存时间只延长了大约三个月，中晚期非小细胞肺癌经验性化疗疗效停滞于平台期，致力于寻找各种敏感的化疗耐药分子标志具有广泛的临床应用前景。分子生物学发展促进与化疗疗效相关的新靶标基因发现，靶向药物作用靶位及下游通路各成员是指导肿瘤靶向治疗的靶标，例如EGFR E19/E21突变肺癌病人选择TKI抑制剂(易瑞沙，特罗凯)；EGFR无突变但高表达肺癌病人选择抗EGFR抗体(爱必妥，帕尼单抗)；EGFR E20/KRAS/RAF/MEK/PI3K/AKT/mTOR突变肺癌病人则以上药物无效，必须选用其他靶向药或治疗手段。
　　开展肺癌个体化化疗的前提与基础是必须进行相关分子靶标检测，即给适合的病人、在适合的时候、予适合的化疗。DNA修复相关基因的表达是指导肺癌个体化化疗的重要靶标。个体性化疗是根据肺癌患者药理遗传学和基因组学特点，采用特异和最佳的化疗药物方案，提高化疗疗效，尽量降低化疗副反应，最大延长患者生存期。国内外研究表明肺癌化疗耐药主要机制包括：(1)药理耐药(pharmacological resistance)：由机体对药物的影响所导致的耐药，如药物进入机体代谢增强或活化障碍、肿瘤血供不足，药物组织穿透力差，导致细胞有效浓度降低；(2)生化耐药(biochemical resistance)：肿瘤细胞的遗传性及生化特性发生复杂的变化，致使细胞通过不同途径对药物产生耐药性；(3)凋亡耐药(apoptosis resistance)：大部分抗肿瘤药物引起细胞死亡是通过细胞凋亡，而促凋亡基因的缺失或抗凋亡基因的过度表达都将相应地导致肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性；(4)微环境耐药(microenvironment resistance)：肿瘤细胞的存活和生长有赖于器官微环境，器官微环境可以通过调节不同耐药基因表达来影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。
　　许多基因与肺癌化疗药物疗效和毒副作用大小密切相关，如代谢酶基因、DNA修复基因、细胞生长及凋亡相关基因、耐药基因等。不同个体对同一种药物具有不同的反应，就是因为这些基因突变或以不同的多态等位基因的形式出现的结果。编码药物代谢酶类的基因发生突变可能影响受药个体对特定药物的反应，进而影响该个体使用该药物的有效性和安全性。比如细胞色素基因家族中的许多基因编码的代谢酶在许多化疗药物的代谢中起重要的作用，基因的不同等位基因多态表达的酶活性的差异，导致个体间药物的有效浓度和毒性差异很大。因此，深入地开展量体裁衣式的肺癌个体化化疗研究具有重要的临床意义。
　　一、错配切除修复酶ERCC1
　　ERCC1是重要的DNA修复基因，它编码的蛋白质与DNA连接酶Ⅲ相互作用，修复DNA单链断裂，并与DNA聚合酶β一起进行碱基切除修复。由于存在SNP，不同个体的XRCC1活性不一样，这可能是导致个体间修复能力差异的分子基础，从而影响铂类药物化疗的疗效。ERCC1是核酸外切修复家族中重要成员,编码297个氨基酸，定位于染色体19q13.2，共有四种分子量的mRNA，但只有111kb的mRNA表达出Mr为33000~36000的蛋白时，才表现其功能是核苷酸切除修复(NER)途径的关键基因，参与DNA链的切割和损伤识别，缺失有功能ERCC1的肿瘤细胞不能修复顺铂导致的DNA损伤，ERCC1mRNA高表达和ERCC1的上调导致铂类药物的耐药。研究表明手术切除的中晚期非小细胞肺癌中ERCC1低表达接受吉西他滨和顺铂联合化疗后生存期明显延长，同时ERCC1表达阴性的肺癌患者接受辅助性化疗显著受益。另外，进展期非小细胞肺癌中ERCC1mRNA低表达的患者中位生存期明显高于高表达者，ERCC1基因多态性与铂类高效有关，纯合子基因型对铂类的客观反应率明显好于杂合子基因。Soria采用标准的免疫组化方法，检测国际肺癌临床试验(IALT)人组的783例手术切除的NSCLC患者肿瘤组织中ERCC1的表达情况，结果显示，783例中761例标本符合分析条件。335例患者(44)的ERCC1阳性，含顺铂方案辅助化疗受益与ERCC1状态有关(P<0.009)。ERCC1阴性的患者随机接受辅助化疗明显延长生存时间，降低死亡风险。因此认为未接受化疗患者，ERCC1表达水平与预后呈正相关，而接受含铂类药物化疗患者，ERCC1表达水平与预后呈负相关，NSCLC根治术后肿瘤组织中ERCC1检测阴性的患者可以从含顺铂的辅助化疗中明显获益。
　　研究已证实ERCC1参与肺癌铂类化疗药物耐药发生，与肺癌疗效和生存期呈负相关，ERCC1阴性者对含铂类化疗药的辅助化疗显示良好的获益率，ERCC1水平可作为铂类药物耐药的关键基因和接受含铂方案治疗患者的独立预后因子。Tomoyoshi等最近研究发现ERCC1存在两种基因多态性(SNP)：T19007C(rs11615)，C8092A(rs3212986)，C8092A有两种多态亚型 CC(70%)和CA(30%)，T19007C有三种多态亚型，CC(45%)，CT(48%)，TT(7%)。 在研究中分别探讨了两种基因类型的功能，C8092ACA型的无病生存期(DFS)和总生存期(OS)明显低于C8092ACA型，T19007C和DFC或者OS无关联性。ERCC1 C8092A的基因多态性是影响NSCLC患者的预后因素，而与ERCC1和铂类敏感性无关联性。
　　二、错配修复控制基因hMSH2
　　错配修复是细胞纠正复制错误的重要手段，常出现在增生过程中，以维持基因的精确性。hMLH1和hMSH2是主要的DNA错配修复控制基因，其基因的蛋白产物功能是识别和修复错配DNA.研究报道，MSH2基因蛋白产物与顺铂损伤后DNA修复相关。Fouret等报告，MSH2蛋白表达可预测顺铂为主辅助化疗非小细胞肺癌患者的生存获益，MSH2阴性或低表达者化疗更有效，若联合评价错配切除修复蛋白(ERCC1)，可达到更好的预测效果。研究者分析了IALT研究数据，并用免疫组化法检测肿瘤组织中MSH2蛋白的表达情况，探讨其与生存的关系。结果显示，中位随访7.5年，共有673例患者可评估，其中257例(38%)MSH2阳性，416例(62%)阴性。在MSH2表达阴性患者中，化疗者的生存期较未化疗者长(58个月 vs. 42个月，P=0.03)，但在MSH2表达阳性患者中，化疗者无显著生存获益(P=0.48)。在对照组中，与MSH2表达阴性的患者相比，MSH2表达阳性者的校正死亡风险比为0.66(P=0.01)。在658例有ERCC1表达数据的患者中，随MSH2和ERCC1标志物阳性数量的增加，化疗获益呈下降趋势(P=0.01)。在MSH2和ERCC1均阴性患者中，与未接受化疗组相比，化疗可显著延长患者的生存期21个月(55个月 vs. 34个月，P=0.01)。MSH2可能与ERCC1联合作为预测NSCLC铂类药物化疗长期获益的预测指标。
　　三、微管蛋白β-tubulin
　　β-tubulin表达与作用于微管类的药物化疗敏感性显著相关，在个体化疗方案制定中起重要作用。紫杉类和长春碱类化疗药物通过微管蛋白的异二聚体成微管相互作用而发挥抗肿瘤有丝分裂疗效。β-butulin的耐药机制与β-tubulinIII表达增加，微管的动态不稳定性增加，对紫杉醇不敏感有关，β-tubulinIII的表达程度影响肺癌对紫杉醇和长春瑞滨的敏感性，其过表达对紫杉醇和长春瑞滨低反率或者是生存期更短，而在卡铂/长春瑞滨的方案可以得到最大的受益。研究发现紫杉醇耐药的肺癌患者中β-tubulin基因改变中位生存期较无基因突变显著降低，因此可将β-tubulin基因突变作为紫杉醇类药物重要的耐药分子指标。非小细胞肺癌中β-tubulinIII低表达者对紫杉醇敏感性较好，同时联合化疗反应率，肿瘤无进展时间和总生存时间均与β-tubulinIII表达有关，大规模的随机临床试验已证实β-tubulinIII是总生存期和无进展生存期一个独立的疗效预测指标和预后因子。另外，β-tubulinIII和ERCC1的表达在患者预后方面存在相关性，两者的阴性表达患者比两者阳性表达或其中一者的阳性表达患者无进展生存期和总生存期明显延长，β-tubulinIII在预测无进展生存期有重要价值，而ERCC1在总生存期方面有更大的预测价值。
　　卡铂和紫杉醇联合化疗是最常用的晚期NSCLC的治疗方案，ERCC1和铂类耐药相关，Tubulin-III和紫杉醇耐药相关，通过评估ERCC1和 Tubulin-III表达是否能预测复发的NSCLC病人用卡铂和紫杉醇联合化疗后PFS和OS。用免疫组化的方法检测两种蛋白的表达，免疫荧光法检测了ERCC1阳性20人， Tubulin-III 阳性16人，ERCC1阴性有明显长的中位无进展生存期(44W vs. 28W P=0.046)，总生存期(102W vs 56 W P=0.010)，Tubulin-III阴性患者有一个相对明显的中位无进展生存期(40W vs 35W P=0.031)，但总生存期相对阳性患者无意义(78W vs. 57W P=0.087)。ERCC1和Tubulin-III两者都是阴性有一个相对于其中一项阳性的患者有更长的PFS(P=0.036)和OS(P=0.015)。多因素分析表明Tubulin-III阴性是一个重要价值的PFS预测因子，ERCC1阴性在预测总生存期方面有更大的预测作用。回顾性分析表明，在接受NSCLC根治术后复发用卡铂和紫杉醇化疗，检测ERCC1和Tubulin-III是一个有用的预测因子，可以作为个体化化疗的重要参考。Reiman等采用免疫组化技术对其中265例患者β微管蛋白III的表达进行了检测。研究者根据肿瘤细胞β微管蛋白III染色强度和数目将患者分为高表达患者和低表达患者。在单独手术组中,与β微管蛋白III低表达者相比,高表达者的无复发生存期和生存期更短。而在手术+辅助化疗(长春瑞滨+顺铂)组中，低表达者与高表达者相似。辅助化疗可显著改善β微管蛋白III高表达患者无复发生存期，但不能改善低表达者无复发生存期。
　　四、核糖核苷还原酶RRM1
　　RRM1基因编码核糖核苷酸还原酶的调控亚基，也是吉西他滨的分子靶点。经吉西他滨长时间处理的细胞系的RRM1表达水平会增高，在接受吉西他滨治疗的患者中，RRM1表达水平低的患者较高表达的患者有较长的生存期。研究结果充分表明肿瘤组织RRM1的表达水平是疾病对吉西他滨/铂类化疗的反应的主要预测指标。ERCC1的表达也有预测作用，但较RRM1弱。DNA修复基因的表达状况可作为肺癌化疗的相对完整的预测因子。RRM1是DNA合成途径中的限速酶，使核苷酸二磷酸盐转变为脱氧核苷酸二磷酸盐，从而在DNA合成和修复中发挥重要作用，并参与吉西他滨的代谢途径，通过微阵列分析发现吉西他滨耐药患者中RRM1高表达，并证实吉西他滨耐药患者中RRM1的关键靶点同时对铂类药物治疗亦有影响。RRM1 mRNA表达是预测吉西他滨/顺铂治疗后生存期的关键指标，低RRM1 mRNA水平的肺癌患者对吉西他滨和顺铂敏感性相对较高，中位生存期延长，而高RRM1表达患者药效性和中位生存期明显下降。因而RRM1 mRNA表达水平可以而且应该用于进行个体化化疗。
　　RRM1和ERCC1的mRNA 表达水平有很强的相关性，在吉西他滨/顺铂治疗组中，RRM1 mRNA表达水平低的患者的中位生存期显著长于表达水平高的患者[13.7 vs 3.6个月；95%置信区间(CI)，9.6~17.8个月；P=0.009]。RRM1和ERCC1 mRNA表达水平均低的患者的中位生存期也显著长于两者均高表达的患者(6.8个月；95% CI，2.6~11.1个月；P=0.016)。RRM1 mRNA 表达是预测吉西他滨/顺铂治疗后生存期的关键指标。RRM1 mRNA 表达水平检测可以应该用于进行个性化化疗。由于RRM1和ERCC是靶向化疗的敏感性分子指标。可根据基因表达高低选择个体化疗方案，RRM1高表达者建议避免使用吉西他滨，ERCC1阴性者可考虑使用铂类药物治疗，可根据下列四种表达情况知道临床化疗：①ERCC1(++)/RRM1(±) 多选择紫杉醇/吉西他滨化疗方案；②ERCC1(+)/RRM1(+)可选择长春瑞滨/紫杉醇方案；③ERCC1(-)/RRM1(±)可选择铂类/吉西他滨方案；④ERCC1(-)/RRM1(++)可选择铂类/紫杉醇方案，为制定肺癌个体化疗方案提供重要指导。
　　五、胸苷酸合成酶TS
　　培美曲塞是一个叶酸和其他抗代谢物的类似体，其独特之处在于含有一个以6-5融合的吡咯嘧啶结构的核心基团，能同时抑制多种叶酸依赖性酶，其中最重要的是TS、DHFR和GARFT三种。TS是一个重要的DNA合成关键酶，它的作用在于限制制造DNA合成所需要的胸腺嘧啶核苷酸生成速度。由于培美曲塞在NSCLC一线、二线及维持治疗中获得了广泛的应用，用TS为分子标志物的临床研究越来越多，Scagliotti指出TS mRNA表达与疗效密切相关，一项III期多中心随机临床对照研究(ITACA)，以观察ERCC1、RRM1和TS对化疗的指导作用。TS在不同组织学类型NSCLC中的表达也有所不同。研究表明未经治疗鳞癌患者的TS mRNA与蛋白水平的表达明显高于腺癌患者，mRNA与蛋白水平间存在高相关性，TS高表达还出现在高分化肿瘤。有临床前研究已经显示TS表达与培美曲塞的敏感性相关，即TS表达越高，培美曲塞的敏感性越低。Yasushi研究116例I-IIIA期的NSCLC患者，采用Taqman反转录PCR(RT-PCR)法检测肿瘤内胸苷酸合成酶(TS)和二氢嘧啶脱氢酶(DPD)的表达水平，以阐明这两个基因的表达水平与5-氟尿嘧啶(5-FU)治疗NSCLC疗效之间的相关性。术后只接受5-FU治疗的患者组成5-FU治疗组(n=30)，只接受手术治疗的患者组成对照组(n=86)。根据TS和DPDmRNA水平的均值进行区分，DPDmRNA低表达的患者接受5-FU治疗的预后明显优于没有接受辅助化疗(P=0.041)。此外，在5-FU治疗组中，TS和DPDmRNA均低表达的10例患者尚无任何复发征兆，而20例TS或DPDmRNA高表达的患者中有8例术后发生了远处转移。定量检测TS和DPDmRNA表达水平可以用于预测NSCLC患者术后5-FU治疗的疗效。TS mRNA表达水平与NSCLC无疾病生存期显著相关。
　　六、微小RNA miRNA
　　miRNA是生物体内源长度约为20~23个核苷酸的非编码小RNA，通过与靶mRNA的互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行负调控，导致mRNA的降解或翻译抑制。千种miRNA存在于多细胞真核生物中，进化上高度保守。分析miRNA表达能预测NSCLC的临床效果，利用实时RT-PCR手段，研究人员获得112例NSCLC miRNA表达数据。通过Cox模型(Cox regression)和风险评分(risk-score)分析，发现5个预测NSCLC治疗效果的miRNA信号。带有这些miRNA信号的高风险基数的病人相对于风险基数低的病人，化疗效果较差。这些miRNA中包括miR-17-5p、miR-20a、miR-21、miR-92、miR-106a和miR-155。而对于编码蛋白的肿瘤抑制子(protein-coding tumor suppressors)和致癌基因，mi RNAs差异表达作用的靶目标会大量富集，其中得到证实的是肿瘤抑制子RB1(Retinoblastoma 1)和TGFBR2 (transforming growth factor, beta receptor II)。此类miRNA信号是NSCLC病患癌症复发和存活的独立预测因子。
　　七、MDR基因
　　肺癌对化疗的反应性因组织类型而异，MDR1与肺癌愈后不佳有关，MDR1因素造成的耐药细胞系在化疗期间扩增而减少药敏细胞，大多数转移的非小细胞肺癌对顺铂、卡铂、VP-16的化疗方案反应率低。研究表明MDR1基因的表达与肺癌的获得性多药耐药和预后不良反应相关，在未治疗的非小细胞肺癌MDR1呈低表达，多程化疗的MDR1基因表达升高，复发者呈高表达。在肺癌尽管耐药发生率很高，P-糖蛋白表达却较低，提示有其他的耐药机制参与，MRP分子在非小细胞肺癌的MDR中扮演重要角色。我们检测发现在术前未接受化疗的肺癌中，MRP基因表达阳性率71.9%，初治肺癌有MRP基因高表达，提示大部分肺癌中先天存在原发性耐药，MRP分子在肺癌的MDR中扮演重要角色。MRP与肺癌先天性多药耐药相关，主要介导肺癌细胞对长春花碱类，足叶乙甙和抗生素类化疗药耐药，若MRP基因表达阳性，应尽量避免应用该类药物。
　　八、TopoⅡ和GST酶系统
　　DNA拓扑异构酶I(DNATopoII)通过催化DNA双链的断裂而改变空间结构，降低ATP与酶结合的能力，影响染色体分离、基因重组和转录及DNA损伤与修复，其效能大于DNA拓扑异构酶I。TopoⅡ既是某些细胞毒药物作用靶点，又是MDR的重要靶酶，介导多种化疗药物的MDR。由于肿瘤细胞具有快速增殖的特性，其TopoII的含量及活性远远高于正常体细胞，因而抑制TopoII活性能阻止肿瘤细胞快速生长增殖，进而杀死肿瘤细胞。除此之外，TopoII抑制剂也可通过增加裂解复合物的稳定性来影响癌细胞的增殖，造成细胞凋亡。虽然它们的作用机制不尽相同，但都是以在细胞生命过程中起重要作用的TopoII为作用靶点。故肿瘤对此类化疗药物的敏感性取决于TopoII的水平，高水平的TopoII表达是药敏的基础，TopoII水平下降，肿瘤对化疗药物的敏感性下降，耐药性增高。临床实验显示GST阳性表达和顺铂、阿霉素耐药相关，但与丝裂霉素和长春新碱耐药的关系不明显。GST的过表达通常与MDR1表达增加相关，GST可协助其底物通过药物排流泵。对耐顺铂的肺癌细胞的研究中发现，细胞质内的谷胱甘肽和过氧化氢酶含量增高，但抑制过氧化氢酶后药物敏感性无明显提高，而抑制谷胱甘肽后药物敏感性明显提高。在研究化疗前后肺癌细胞耐药情况时发现，化疗后株与化疗前株相比，对阿霉素的耐药性增加3倍，对顺铂的耐药性增加2.7倍，但未见MDR1基因表达，而GST水平明显升高，说明其化疗耐药性与GST活性有关。
　　九、凋亡信号通路
　　MDR1编码的P-糖蛋白除经典的化疗药物排除泵功能外，尚具有对Caspase依赖的凋亡途径保护的作用，其抗凋亡的机制可能是P-糖蛋白使细胞内碱化，诱导一种新的Na+和Cl-依赖跨膜H+转运，导致细胞内pH值增加，使Caspase处于失活状态，从而对Caspase依赖的细胞凋亡具有保护作用。半胱氨酸酶Caspase家族是直接导致细胞解体的蛋白酶系统，在线粒体凋亡调控机制中处于核心地位。Caspase-3主要的底物是聚腺苷二磷酸核苷聚合酶(PARP)，可将116kDa的完整PARP裂解成大小两个片段，PARP与DNA修复和基因完整性监护有关，能结合到损伤的单链或双链DNA上并激活，利用NAD为底物，不停将ADP共价联到核蛋白，以修复DNA损伤，断裂片段催化活性要比完整的PARP全酶低得多，结果使PARP负调控的核酸内切酶活性增高，裂解核小体间的DNA引起细胞凋亡。抑制PARP可导致细胞内单链DNA断裂的积聚，导致复制叉处双链DNA断裂。正常情况下细胞内的另外一套修复系统，即无差错同源重组双链DNA修复系统，可对复制叉处双链DNA的断裂进行修复。该系统的主要成员即为抑癌基因BRCA1和BRCA2。若生殖细胞在BRCA1或BRCA2的一个等位基因发生突变，则该个体患肿瘤风险增加，一旦另一个等位基因发生突变，则无差错同源重组双链DNA修复系统功能下降，细胞发生突变的几率明显增加，很有可能转化为肿瘤细胞。若给予这些细胞PARP抑制剂，根据合成致死理论，这些细胞将死亡，而正常细胞却不受影响。在体外试验中，BRCA1或BRCA2突变的细胞对PARP抑制剂的敏感性是正常细胞的1000倍。英国癌症研究所PARP抑制剂的Ⅰ期临床研究，共入组60名晚期实体瘤患者。结果显示在可评估的BRCA1或BRCA2突变的19例患者中，服用PARP抑制剂后都有效。其中12例(63%)的疗效得到影像学、肿瘤标志物或肿瘤稳定期的证实。
　　通过开展全面肺癌个体化化疗相关靶标检测技术和评价的规范化研究，尽早确立肺癌患者耐药分子标志基因与疗效内在明确关系，根据肺癌患者化疗耐药分子标志，指导并准确选择和制定个体性化疗方案，有望最终大幅提高NSCLC疗效和生存质量，实现肺癌个体化性化疗的新飞跃。
参　考　文　献
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