临床肿瘤基因组学指导下的结直肠癌个体化治疗

临床肿瘤基因组学指导下的结直肠癌个体化治疗
上海交通大学附属第一人民医院肿瘤诊治中心　王理伟　李　宁　宋卫峰　周　翡

　　一、概述
　　(一)　描述流行病学(Descriptive Epidemiology)
　　结直肠癌在全球年发病人数约为100万例，列第3位。2006年中国卫生统计提要示大肠癌病死率位居恶性肿瘤第5位，平均5年生存率为27%，男性略高于女性，发病年龄在50岁以上多见。发达及沿海地区多见，尤以长江中下游地区的发病率和死亡率最高。目前国内发病率以每年4.2%的速度上升，全世界以3%的速度上升。
　　(二)　病因学(Etiology)
　　随着对肠癌发病原因的研究深入，可以肯定的相关高危因素如下：
　　1、饮食和生活方式
　　动物脂肪和蛋白质的摄入过高、食物纤维素摄入不足，静坐生活方式、缺少运动是大肠癌尤其是结肠癌的主要高危因素。
　　2、遗传因素
结肠癌具有典型的家族聚集现象，普通人群中大肠癌的终身发病危险率大约为5%~6%，而有家族遗传危险性的患者大约占所有大肠癌患者的20%，其中5%~10%的患者呈常染色体显性遗传。遗传性大肠癌有两种主要形式：家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis，FAP)和遗传性非息肉病性结肠癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer，HNPCC)。FAP多通过染色体不稳定途径的机制发病，主要表现为多发性的大肠腺瘤；而HPNCC则为错配修复基因(MMR)突变，其中大部分与 MSH2及MSH1突变有关。上述两肿瘤家系随年龄增长近100%均发生恶性肿瘤。
　　3、癌前病变
　　(1)　肠息肉及肠腺瘤：是由腺上皮逐步发生的良性肿瘤，其上皮具有异型性，存在较大的癌变危险。腺瘤于5、10、20年发展为癌的累积率分别为2.5%、8.0%、24.0%。
　　(2)　炎症性肠病：以溃疡性结肠炎为例，肠粘膜可出现黏膜的异型增生和癌变，可无息肉阶段。基于116项研究的一项Meta分析得出溃疡性结肠炎患者结直肠癌总的发病率约为3.7%。而Crohn病患者发生癌的危险性较一般人群高440倍。
　　而下列因素可能与肠癌的发生有关：微量元素缺乏、糖尿病与便秘、吸烟与饮酒、社会心理因素、非甾体抗炎药。
　　二、结直肠癌的靶向治疗及生物学标志物
　　(一)　结直肠癌的靶向治疗(Target Therapy in Colonrectal Cancer)
　　分子靶向治疗药物的出现为肠癌的治疗带来新的希望，单独或联合应用靶向药物不仅能提高有效率，而且明显延长患者生存期。但目前靶向治疗依然存在误区：即盲目应用甚至是滥用靶向药物，不仅给患者带来极大的经济负担，而且也增加了肿瘤耐药的风险。
　　靶向药物都有着明确的作用靶点，例如西妥昔单抗(Cetuximab)和贝伐单抗(Bevacizumab)相对应的靶点是EGFR、VEGF，但仍然不明确的是靶点与其上下游基因、与其细胞传导通路、与各基因之间相互作用的关系等，在种种不确定因素下，盲目的、不加选择的应用靶向药物，往往会事倍功半，使疗效大打折扣。
　　(二)　生物学标志物(Biomarks in Colonrectal Cancer) (表1)

表1生物学标志物(Biomarks in Colonrectal Cancer)

*Bengala, et al. ASCO 2009；Bokemeyer, et al. JCO 2009；Chung, et al. Anticancer Res 2006；Chung, et al. J Surg Oncol 2006；Di Nicolantonio, et al. JCO 2008；Lambrechts, et al. ASCO 2009；Loupakis, et al. JCO 2008；Sessa, et al. Nat Clin Pract Oncol 2006.

　　三、肿瘤基因组学指导下的个体化治疗
　　2008年ASCO建议应用西妥昔单抗治疗前检测K-ras基因的状态，2009年NCCN正式的将K-ras检测作为的肠癌EGFR靶向治疗前必检项目。这标志着肿瘤基因组学指导下的结直肠癌个体化治疗初现曙光。
　　(一)　临床肿瘤基因组学(Clinical Cancer Genomics)
　　是在人类基因组学的基础上，寻找癌相关基因组及遗传序列、筛选及检测肿瘤特异性或相关性表达、判断基因间相互关系、并比较个体之间基因差异，帮助确定肿瘤分级与分期，最终用于指导临床肿瘤个体化治疗。
　　2005年12月，美国NIH(National Institutes of Health)组织NCI(National Cancer Institute)和NHGRI(National Human Genome Research Institute)共同启动开展了肿瘤基因组研究计划(The Cancer Genome Atlas，TCGA)。该计划首先选择了各500例的肺鳞状细胞癌、卵巢浆液性腺癌和脑多形性胶质瘤进行癌症基因组图谱研究。目前美国9家医院的临床癌症中心和5家临床基因测序中心已经加入到这项研究计划中，并建立了样本资源中心和临床遗传信息处理中心。该计划运行四年多来，已经获得近10TB的分子遗传学序列以及大量临床诊断关联信息和计算数据，主要用于建立肿瘤病理学分类相关的分子诊断标准并指导肿瘤个体化治疗。
　　TCGA的主要研究目的是发现用于解码肿瘤细胞的分子结构所需的信息和技术工具，并增强人类对癌症遗传基础的认识。通过基因组分析技术，包括大规模的基因测序技术的应用，全面致力于癌症分子遗传基础的研究，其最终目标便是提高人类诊断、治疗以及预防肿瘤的能力。目前，肿瘤基因组学研究的主要内容包括：染色体重排；肿瘤相关DNA的插入、缺失、置换等突变；能激活或灭活癌基因的DNA化学修饰；候选基因mRNA定量表达；与肿瘤发生及化疗相关的基因分型；甲基化表达遗传改变；调控区片段分析和微卫星不稳定性(MSI)分析；miRNA靶点和干扰等。
　　TCGA的主要任务是：(1)建立系统化方法来鉴别肿瘤遗传学改变，系统的应用基因组分析技术对那些与肿瘤关系密切的全体候选基因及染色体部位进行定位和鉴别。(2)将候选基因与NHGRI已有的测序基础紧密联系以便对它们进行再测序。(3)应用已知的肿瘤关联基因mRNA定量、miRNA定量表达分析、表遗传、单核苷酸多态性(SNP)和MSI分析等技术完成大脑多形性神经胶质瘤、肺鳞癌和卵巢浆液性癌3类肿瘤的基因组分析、鉴定肿瘤相关的特异性基因改变、对基于基因改变的肿瘤病理亚型进行分子病理学分类，通过基因分子标志进行客观性自动化的分子病理诊断。(4)对基于基因改变的肿瘤疗效变化进行转化医学个体化治疗关联分析，鉴定选择药物靶向基因，为高效低毒基因靶向药物提供分子靶点。(5)对基于基因改变的肿瘤发育、进展、转化等生物学行为相关基因进行关联分析，以确定肿瘤发生流行病学和终点事件的准确基因标志。通过肿瘤研究的公共机构使研究所得的基因组数据成为人类共享的资源，建立公共的免费的数据库平台，以实现全球病理诊断标准化，并继而推动基因临床转化为诊疗活动的规范化。
　　(二)　肿瘤个体化治疗(Personalized Cancer Care /Treatment)
　　运用新型分子分析方法，根据病人的遗传特征以及所处环境的特点来帮助医师和病人选择最有效的疾病治疗方法，更好地控制疾病的进展甚至预防疾病的发生，从而实现最佳的医学治疗效果。即在合适的时间(Right Time)给合适的病人(Right Patient)施行合适的治疗(Right Treatment)(图1)

图1

　　(三)　结直肠癌肿瘤相关基因及个体化治疗(Cancer-associated genes and personalized treament in colonrectal cancer)
　　1、EGFR、西妥昔单抗(Cetuximab)与K-ras基因突变
　　EGFR(Epithelial Growth Factor Receptor)属于Erb2B 酪氨酸蛋白激酶家族，由三部分构成：(1)621个氨基酸残基组成的胞外区；(2)23个氨基酸残基构成的跨膜区；(3)剩余542个氨基酸残基构成的胞内区。EGFR膜外区域由配体结合位点和2个富含半胱氨酸区域所构成，能结合具有激动功能的多种配体，主要有表皮生长因子和转化生长因子α。EGFR与配体结合后发生二聚化，导致其胞质区中的酪氨酸残基磷酸化，从而激活了受体中酪氨酸激酶的活性，并进一步激活下游的Ras-Raf-MEK-ERK等信号通路，从而调节细胞对外界刺激的反应、细胞增生、存活、黏附、迁移和分化等。研究发现EGFR信号在结直肠癌形成中具有重要的作用，约65%~70%的结肠肿瘤过表达，其表达与肿瘤临床分期、淋巴结受累及范围、血管浸润转移等关系密切，提示EGFR 信号途径和结直肠癌的进展和转移有关。
　　西妥昔单抗是嵌合型单克隆抗体，与EGFR具有较强的亲合力，可结合EGFR以阻止EGF激活受体，抑制下游信号传导从而干扰肿瘤生长、侵袭和转移以及细胞修复和血管生成。临床前期研究显示西妥昔单抗可抑制包括人非小细胞肺癌、大肠癌、前列腺癌等肿瘤细胞株的生长及肿瘤细胞株裸鼠移植瘤的生长。西妥昔单抗与多种细胞毒性化学治疗药物具有协同抗肿瘤作用，对放射治疗有增敏作用。是首个获得FDA批准用用于结直肠癌的靶向药物。
　　随着西妥昔单抗的推广应用，人们逐渐发现它的效果并不理想。进一步研究发现，在结直肠癌中靶向EGFR治疗的效果与K-ras基因状态密切相关，即抗EGFR治疗仅对K-ras基因野生型有效，而对突变型无效。结直肠癌的发生发展是涉及多基因、多步骤改变的复杂过程，与癌基因的状态密切相关，K-ras基因功能正常时(即野生型)，抗EGFR单抗与EGFR结合，抑制EGFR二聚体，阻断信号通路，阻断肿瘤生长；K-ras基因突变后可旁路激活细胞内信号传导，导致抗EGFR单抗丧失抗癌活性，即治疗失败(图2)。

a)EGFR通过K-ras基因被TGFα、EGF等配体激活，激活肿瘤细胞内信号转导；b)K-ras基因功能正常时（即野生型），抗EGFR单抗与EGFR结合，抑制EGFR二聚体，阻断信号通路，阻断肿瘤生长；c)K-ras基因突变后可旁路激活细胞内信号传导，导致抗EGFR单抗丧失抗癌活性，即治疗失败。

　　2008年ASCO公布的结直肠癌CRYSTAL试验和OPUS试验，首次在大样本随机对照临床研究中证实，对转移性结直肠癌患者，K-ras基因有无突变与西妥昔单抗的疗效明确相关。K-ras野生型患者从西妥昔单抗联合FOLFIRI或FOLFOX方案化疗中获得明显的疗效和生存优势；而K-ras突变型患者则不能从靶向药物联合化疗中获益。这一研究使K-ras成为第一个结直肠癌靶向治疗疗效预测的重要分子标志物。此后的一系列研究进一步证实在结直肠癌的靶向EGFR的单克隆抗体联合化疗中，对K-ras基因的突变检测具有重要的疗效预测价值。因此，在2008年版的结肠癌诊疗指南中，原来推荐使用西妥昔单抗的部分，全部更改为根据基因突变检测结果而决定，使西妥昔单抗的使用更具有选择性和针对性。
　　K-ras基因突变型结直肠癌患者约占40%，这类患者不能从抗EGFR治疗中获益。而其余60%左右的K-ras基因野生型患者是否都能从这类药物治疗中获益？事与愿违，即使Kas基因为野生型，在标准治疗中仅有22%的患者能够获益，而约5%的患者需通过增加剂量才能获益(图3)。随着研究的深入，发现在Kas基因为野生型的结直肠癌患者如出现BRAF、PI3K的突变或PTEN的缺失，也不能从抗EGFR治疗中获益。此外Epiregulin、Amphiregulin表达水平等可能同样影响抗EGFR治疗的效果。这些结果提示单个基因的检测还不能精确的预测靶向治疗的效果，需要多个基因的联合检测。

图3　K-ras状态与EGFR单抗治疗效果的关系

　　2、贝伐单抗(Bevacizumab)与“反跳效应”
　　VEGF是一个分子质量约45kDa的同二聚体糖蛋白，主要作用为刺激病理性血管形成，通过作用于血管内皮细胞上高亲和力的酪氨酸激酶受体 Flk-1和KDR/Flk-1发挥生物学作用，从而调节血管生成。作为已知最强的血管渗透剂和内皮细胞特异性有丝分裂原，VEGF在内皮细胞的增殖、迁移和血管构建中起重要作用。VEGF的表达水平与肿瘤组织的血管化程度和恶性程度呈显著正相关，约50%的结直肠癌有VEGF表达，其表达与肿瘤预后较差有关。
　　贝伐单抗是一种抗VEGF的人源化单克隆抗体(IgG1)，由93%的人源结构域和7%的鼠源结合区域组成，通过与体内VEGF的竞争性结合，阻止VEGF与其相应受体结合，进而阻断肿瘤新生血管的形成。另外，可使肿瘤及其周围组织的血管分布正常化，因此有利于化疗药物的传递。贝伐单抗单药或联合化疗治疗晚期结直肠癌的疗效已初获证实，并于2004年2月由FDA批准上巿，是全世界第一个被批准用于抑制血管生长的单克隆抗体药物。
　　但是，值得注意的是，长期使用贝伐单抗后，VEGF水平不会如预期下降，而是会在一定程度上升高，这就是VEGF的“反跳效应”，其原因是下调的VEGF会通过负反馈途径激活其上游转录因子Sp1的表达，Sp1的高表达又会连锁的使其下游VEGF表达上调，结果即长时间使用贝伐单抗后，VEGF的水平不会下降反而会升高，使抗肿瘤血管作用减弱。虽然这种假说仅仅在实验室中予以证实，但对于临床来说，提示我们要适时的检测转录因子Sp1的表达状态，以便及时调整靶向治疗方案。最近的研究发现在使用贝伐单抗治疗结直肠癌时，PlGF和bFGF水平升高往往早于疾病的进展，提示PIGF和bFGF可作为贝伐单抗耐药的预测标志物。
　　3、5-Fu与错配修复系统(mismatch repair，MMR)
　　5-Fu是临床最广泛使用的肿瘤化疗药物之一，尤其在消化道肿瘤、乳腺癌和头颈部肿瘤治疗中发挥着重要作用。近年来5-Fu的临床应用和多项研究结果表明：5-Fu药物代谢基因在不同个体之间存在遗传多态性的差异。并且这种差异导致5-Fu药物代谢酶活性发生改变，从而导致不同个体之间存在药物敏感性和不良反应的差异。5-Fu药物代谢相关的多个基因的遗传多态性均与其疗效和不良反应在不同个体之间存在差异。其中，最常见的包括二氢尿嘧啶脱氢酶基因(DPYD)、嘧啶核苷合成酶基因(TS)和亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)。
　　DPYD广泛分布于各种正常组织，以肝脏和外周血单核细胞中分布最多，它是5-Fu在肝脏和其他细胞中代谢失活的限速酶，约 80%~90%的5-Fu在肝脏中被分解代谢。因此，DPYD活性的高低直接决定了5-Fu合成代谢生成核苷类似物和分解代谢排出体外的量。DPYD活性与人种、性别、年龄、肿瘤部位、分期、分化、病理类型等均无关，约1%人群的DPYD活性完全丧失，约3%~5%人群的DPYD活性部分丧失。当DPYD 活性降低或缺失时，5-Fu的分解代谢减弱，导致5-Fu在体内清除受阻，从而导致5-Fu的不良反应明显增强；当DPYD活性显著增高时，5-Fu分解代谢增强，合成代谢降低，导致5-Fu经合成代谢生成具有生物学活性的核苷类似物的能力减弱，从而易导致对5-Fu治疗的耐药现象。
　　TS是嘧啶核苷酸合成的限速酶，也是5-Fu发挥细胞毒作用的目标酶，因此，当TS因遗传性多态性差异导致其活性存在差异时，不同个体对5-Fu的敏感性和不良反应也会存在明显的差异。MTHFR是叶酸代谢途径中的关键酶之一，也是影响5-Fu发挥作用的关键酶。研究结果表明，MTHFR的多态性与其表达活性存在显著的相关性。例如，在晚期胃癌中，MTHFR野生型患者的化疗有效率可达83.3%，而杂合型和突变纯合型则分别只有15.2%、8.3%。
　　错配修复系统(mismatch repair，MMR)是一种重要的DNA复制后修复系统，起着维持DNA复制保真性，控制基因突变的作用。目前已发现多个参与错配修复功能的基因，其中hMSH2，hMLH1是MMR家族最重要的基因。目前在散发性结直肠癌中认为MMR系统中hMSH2和hMLH1启动子CpG岛的甲基化，引起基因沉默，hMSH2和hMLH1蛋白表达缺失，造成微卫星不稳定(MSI)，导致肿瘤形成。研究表明，有缺陷的MMR系统可降低5-Fu的细胞毒性、降低疗效。2008年ASCO年会一项回顾性研究发现错配修复(MMR)基因状态可以预示II期肠癌患者是否能从以5-Fu为基础的辅助化疗中获得生存益处。这项研究发现，MMR系统存在缺陷(即突变型)将导致微卫星不稳定性的患者不仅不能从辅助化疗中获益，而且还可能降低5年生存率。上述研究表明5-Fu用于结直肠癌治疗前或是治疗过程中，检测MMR基因的状态会对疗效和预后有明显的提示作用。
　　4、伊立替康与UDP2葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1)
　　伊立替康(CPT11)是一种无活性的前药，需经羟酸酯酶的活化转变为其活性代谢产物 SN238而发挥效用。活性SN238的主要清除途径是通过肝脏UDP2葡萄糖醛酸转移酶1A1(U GT1A1)的糖基化作用转变为无活性的SN238G，后者通过尿液和胆汁排出人体外。UGT1A1基因的多态性与其表达活性相关，可用于临床预测CPT11严重不良反应的发生概率。目前，该项检测项目已经被FDA批准应用于临床上对伊立替康药物敏感性和不良反应的预测指标。已有的临床验证结果表明，UGT1A1启动子区TATA盒中的TA重复次数与UGT1A1的表达活性显著相关；UGT1A1常见的TA重复次数是6次(6TA)，当TA重复次数增加时，UGT1A1的表达活性下降，导致CPT11的疗效显著降低和不良反应显著增强。因此，了解UGT1A1启动子区TATA盒中TA的重复次数对于临床是否采用CPT11对患者进行化疗处理具有积极的指导意义。
　　5、奥沙利铂与核苷切除修复基因(XPD)
　　奥沙利铂是第三代铂类复合物，已知导致其耐药的机制是核苷切除修复基因(XPD)，即：ERCC2存在多态性。ERCC2的751位密码子突变后(赖氨酸替换至谷氨酰胺)，结果使奥沙利铂化疗疗效减弱。另有研究显示编码精氨酸(或谷氨酰胺的外切修复酶XRCC1的399位密码子的多态性也影响奥沙利铂治疗的疗效。奥沙利铂化疗有效的患者73%携带arg/arg基因型，而无效患者66%携带glu/glu或glu/arg基因型。结合型谷胱苷肽(GSH)依赖酶能消除铂类复合物的作用。GSH-S转移酶亚型(GSTP1，GSTM1，GSTT1)的多态性可能降低或消除GST的活性。GSTP1基因105位密码子编码缬氨酸(val)或异亮氨酸(iso)。在一项107例奥沙利铂化疗研究中，val纯合子中生存期为24.9个月iso纯合子7.9个月，杂合子13.3个月。GSTM1和GSTT1与有效率或生存期无关。
　　四、结论与展望
　　基因组学研究已经进入功能基因组学时代，以基因测序技术为核心的新技术平台支撑体系正在逐步建立，个体化基因诊断的时代已经到来并将对肿瘤医学产生深刻的影响，使临床肿瘤基因组学指导下的个体化治疗已成为可能。
　　但是肿瘤基因组学不单单只是几个简单的基因排列组合，它是一项前所未有的庞大工程，以美国TCGA为例，TCGA拥有四大组成机构，分别是：中央生物样品核心资源库、肿瘤基因组特征认证中心、基因组测序中心和信息资料协调中心。体现了肿瘤病理标本资源鉴定分析－癌基因特征初步筛选－候选基因测序－数据网络信息分析的总路线。这其中不仅有医务人员与患者的参与、还有生命科学、分子生物学、信息学和管理学等专业人员参与合作。
　　通过临床肿瘤基因组学的研究，可以筛选并发现不同患者对同种药物治疗存在个体差异的遗传指标，并通过检测这些指标向临床医生提供实验数据，从而使临床医生在治疗药物的选择上更精确，以提高抗肿瘤药物治疗的安全性和有效性，从而实现真正意义上的肿瘤个体化治疗。
参　考　文　献
[1] D. Max Parkin at el. CA Cancer J Clin 2005;55:74-108.
[2] Dulbecco R. A turning point in cancer research: sequencing the human genome. Science, 1986, 231 (4742), 1055-1056.
[3] Scaltriti M, Baselga J. The epidermal growth factor receptor pathway: a model for targeted therapy. Clin Cancer Res, 2006, 12:5268-5272.
[4] BekaII-Saab T. K-RAS Testing in Metastatic Colorectal Cancer: Implications on the Use of Biologic Agents.Clin Colorectal Cancer. 2009, 8(3), 135-140.
[5] Sartore-Bianchi A, Martini M, Molinari F et al. PIK3CA mutations in colorectal cancer are associated with clinical resistance to EGFR-targeted monoclonal antibodies. Cancer Res. 2009, 69(5):1851-1857.
[6] Gill S, Goldberg RM. Cetuximab, chemotherapy and K-RAS status in mCRC. Nat Rev Clin Oncol. 2009, 6(7):379-380.
[7] Keping Xie, Daoyan Wei, Suyun Huang, Transcriptional anti-angiogenesis therapy of human pancreatic cancer. Cytokine Growth Factor Rev, 2006, 17(3), 147-156.
[8] Ferrara N, Hillan KJ, Novotny W. Bevacizumab (Avastin), a humanized anti-VEGF monoclonal antibody for cancer therapy. Biochem Biophys Res Commun. 2005, 333(2), 328-335.
[9] Abdelrahim M, Smith R 3rd, Burghardt R, et al. Role of Sp proteins in regulation of vascular endothelial growth factor expression and proliferation of pancreatic cancer cells. Cancer Res, 2004, 64(18), 6740-6749.
[10] Gamelin E, Delva R, Jacob J, et al. Individual fluorouracil dose adjustment based on pharmacokinetic follow-up compared with conventional dosage: results of a multicenter randomized trial of patients with metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol. 2008. 26(13): 2099-2105.
[11] Kim JC, Roh SA, Cho DH, et al. Chemoresponsiveness associated with canonical molecular changes in colorectal adenocarcinomas. Anticancer Res. 2009, 29(8):3115-3123.
[12] Assenat E, Duffour J, Ychou M. Irinotecan for the treatment of metastatic colorectal cancer, Bull Cancer. 2006, 93(5): 507-515.
[13] 徐农, 药物遗传学在结直肠癌化疗中的应用. 实用肿瘤杂志, 2005, 20(6), 469-472.
[14] 徐建明, 韩宇. 结直肠癌分子靶向治疗的现状和展望. 实用肿瘤杂志, 2005, 20(6), 465.
[15] 方福德. 与肿瘤个体化诊疗相关的科技计划. 中华肿瘤杂志, 2006, 28 (10), 798.
杜益群, 赖仁胜, 许红英. 癌症基因组研究计划概述. 现代肿