试剂盒说明书

前     言

　　由于药物抗癌的选择作用、个体差异性、多重抗药性（原、继发性）等因素的影响，肿瘤个体对药物的敏感性和耐药性不同，即使是同一组织学类型，分化程度相同的肿瘤对同一药物的敏感性也不同。因此，选择和确定针对个体的化疗敏感药物，既可以减少化疗的盲目性，又可以避免不必要的机体损害和多重抗药性的产生，提高治疗效率。

　　本试剂盒是通过肿瘤细胞体外给药培养，经生物荧光系统(ATP-TCA)测定活细胞指标ATP，进而判断抗肿瘤药物的敏感性和抗性。具体而言，荧光酶在有氧条件下,可以和底物荧光素结合后催化ATP转变成AMP,并同时释放出荧光（波长为 562nm），测定所产生的荧光强度,可获得ATP的含量。再根据细胞内ATP含量与 细胞活性状态在一定范围内呈线性关系，通过对细胞内ATP含量(10-13～10-5mol/L)的测量可计算出活细胞数量。

　　由于采用了ATP生物荧光技术，以ATP含量作为测定细胞活性的指标，本试剂盒具有灵敏度高、特异性好、周期短、临床相关性好、可测性高等优点，并配有自动化的扫描设备、统计分析系统，检测分析方便、快捷。

　　本试剂盒注册号：国食药监械(试)字2005第3070035号
　　本试剂盒执行标准：YZB/国 0535-2003
　　医疗器械生产企业许可证：京药管械生产许 20040032 号
 

本试剂盒主要用途及适用肿瘤类型：
　　1、体外筛选对肿瘤细胞敏感的化疗药物，为个案化治疗方案提供客观依据；
　　2、研究和确定新的化疗方案和治疗原则；
　　3、评估联合用药方案；
　　4、研究肿瘤耐药机制；
　　5、体外筛选新药；
　　6、适用肿瘤类型：卵巢癌。

1 操作步骤：（以下均为无菌操作）

1.1 标本的处理和运送：
1.1.1实体瘤标本的处理、运送
　　为了获得足够数量的活肿瘤细胞，要切取肿瘤细胞较多、未坏死液化的部分，标本不应小于1.0克。取出标本后应立即浸入装有PBS或RPM11640培养液的无菌小瓶中,并在最短时间内（3小时内）送抵实验室。标本置于标本浸泡液中浸泡15分钟。
标本浸泡液配方：400u/ml庆大霉素，500ug/ml氨苄青霉素，3ug/ml两性霉素，制霉菌素125u/ml,溶解于RPMI 1640培养液。
1.1.2胸腹水标本的处理、运送
　　因胸腹水中细胞数量多少不一，应尽量多收集标本，不少于500ml，按 20u/ml的浓度加入肝素抗凝。

1.2 肿瘤细胞悬液的制备：
1.2.1实体瘤
　　组织消化液配制：将10ml RPMI 1640培养液加入到组织消化酶冻干瓶中充分混合溶解，过滤除菌，置于50ml无菌塑料离心管中待用。
　　除去标本浸泡液,剥离肿瘤标本表面的结缔组织、纤维和脂肪，用无菌剪刀将标本剪碎成1mm3的碎块,然后将其转移至含组织消化液的离心管中。
　　将离心管倾斜置于37℃孵育箱中孵育1.5-3小时,每隔15-30分钟振摇一次,使其充分消化。
　　消化结束后用10ml吸管反复吹打消化混合液，使组织块完全分散。
　　洗涤细胞。加入35ml RPMI 1640培养液，混匀后400g离心10分钟，去上清。如有大量红细胞（>25%），参考1.3去除。然后加入35ml RPMI 1640培养液混悬沉淀物，400g离心10分钟，去上清。加入3-5ml培养基混匀制备得细胞悬液。   
　　细胞计数。吸取一定量的细胞悬液,适当稀释后台盼蓝染色计数。
1.2.2胸腹水标本的制备
　　将肝素抗凝的胸腹水标本， 400g离心10分钟， 弃上清。如有大量红细胞（>25%），参考1.3去除。加入30mlRPMI 1640培养液混悬沉淀物，400g离心10分钟，去上清，加入3-5ml培养基混匀制备得细胞悬液。计数备用。
1.2.3培养的肿瘤细胞系
　　贴壁细胞。用0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA消化细胞，收集后用20ml培养基400g离心10分钟，弃上清，用3ml培养基混匀细胞，计数后备用。
　　悬浮细胞。400g离心10分钟，去上清，用3ml培养基混匀细胞，计数后备用。

1.3. 去除红细胞
　　第一次离心后，去除上清，加入预冷的10ml红细胞裂解液，使细胞悬浮，冰浴5-10分钟后加入20mlRPMI 1640培养液，400g离心10分钟,去上清。红细胞较多的胸腹水标本，冰浴时间延长15-20分钟，并轻摇两次。

1.4 加药步骤
1.4.1准备待测化疗药物
　　根据待测药物的临床使用剂量及其所对应的血浆峰值浓度（peak plasma concentration,PPC），设定6个检测浓度,即200%、100%、50%、25%、12.5%、6.25%的PPC。每个浓度作2个平行孔。同时设定M0：无药对照孔，MI：最大抑制孔。
　　注意：必须根据厂家的说明来准备和储存药物。附表列举了化疗药物临床使用剂量与血浆峰值浓度。
　　△ 用培养基来配制800％PPC的待测药物。
　　△ 用多道加样器，向A-G排加入0.1ml培养基。
　　△ 用可调加样器，向A行各孔中加入0.1ml 800％PPC的待测药物。
　　△ 用多道加样器，从A→F行倍比（2×）稀释药液，最后的0.1ml弃去。这样从A行到F行，药物的浓度是400％-12.5％PPC。
　　△ 用多道加样器，在H1-H12孔中加入0.1ml ATP生成抑制剂，即MI孔（进行下一步前请更换吸头）。
1.4.2细胞接种和培养
　　一般情况下，细胞接种数量在2-4万/孔之间可以得到比较好的试验结果。
　　(接种细胞时请严格按下列顺序操作。)
　　计数后，确定接种细胞量。用培养基稀释至细胞密度为20－40万/ml。
　　用多道加样器，从A行到F行，每孔加入0.1ml的细胞悬液,这样，从A行到F行每孔的细胞数为2－4万个,而药物浓度为200％-6.25％PPC。
　　在G行，M0对照孔用多道加样器每孔加入0.1ml细胞悬液。
　　在H行，MI对照孔用多道加样器每孔加入0.1ml细胞悬液。
　　将培养板放置在湿盒内，置于37℃，5％ CO2 饱和湿度的细胞培养箱内培养5－7天。注意：培养期间保持孵箱内湿度大于95％。

1.5 肿瘤细胞生长状态观察
　　肿瘤细胞接种以后在孵箱中培养5－7天。在此期间应每天该对肿瘤细胞生长状态进行观察，以便及时了解细胞培养情况，如有无细菌或真菌污染，接种是否均匀，肿瘤细胞是否贴壁和伸展，以及其克隆生成情况。

1.6 ATP的提取及荧光测定
　　完成5-7天培养后，即可提取细胞ATP进行测定。
1.6.1 ATP的提取
　　（此处严格按下列顺序操作）
　　配制荧光酶-荧光素系统工作液。将12ml荧光酶工作液加入到荧光酶-荧光素系统中，充分溶解混合配成发光工作液，室温避光放置10分钟。
　　用多道加样器自A-G行顺序将ATP提取液加入96孔培养板，每孔加入50ul，更换吸头向H行加入50ulATP提取液。室温静置5分钟后振荡20-30秒，等待测定。
1.6.2荧光测定
　　完成ATP提取以后，用多道加样器自96孔培养板A-G行顺序依次吸出50ul上清液，更换吸头从H行吸出50ul上清液，对应加入到荧光测定板中。
　　在荧光测定板中每孔加入50ul发光工作液，在微量振荡器上振荡10秒钟，立刻用荧光扫描仪测定。

1.7　ATP标准曲线绘制
　　向ATP冻干瓶内加入无菌去离子水2ml，充分溶解，溶液浓度为250ng/ml。
　　系列稀释（3倍）ATP溶液，ATP含量依次为 ：250、83.3、27.4、9.1、3.0、1、0.33、
 

　　0.11ng/ml加入配好的发光工作液，每个浓度取50ul，设3个平行孔即刻进行测量。
　　以每个梯度平均荧光值为纵坐标，ATP含量对数值为横坐标做标准曲线，计算相关系数和变异系数。

2　自动数据传输和分析
　　测量后，所有数据传输到计算机里并自动生成EXCEL表格形式文件，该表格已经预设定好了公式，自动计算每种药物每个浓度的肿瘤生长抑制率，绘制抑制曲线图，并可自动计算各药物的IC50和IC90，按下列评价标准判定药物敏感性。

3　评价标准  
　　以下是肿瘤对化疗药物敏感性的评价标准: 
　　高度敏感：IC50<25%PPC及IC90<100%PPC
　　中度敏感：IC50<25%PPC及IC90>100%PPC
　　轻度敏感：IC50>25%PPC及IC90<100%PPC 
　　耐   药 ：IC50>25%PPC及IC90>100%PPC
  
　　IC90：抑制90%肿瘤生长时的血浆峰值浓度
　　IC50：抑制50%肿瘤生长时的血浆峰值浓度
　　PPC：一定临床用药剂量对应的血浆峰值浓度
　　注意事项：
　　△ 本试剂盒只限于体外使用。
　　△ 标本处理和实验时务必戴手套并保持无菌。
　　△ 实验和标本处理过程中必须严格无菌操作。
　　△ 有些试剂见光会分解，必须储藏于干燥避光的地方，处理过程中也必须有不透光的铝箔包裹。
　　△ 禁止使用包装破损的培养板，以防止污染。
　　△ 禁止使用过期产品。
　　△ 操作者应注意防范化疗药物可能造成的危害及对环境污染。

5　贮存条件、有效期
　　2-8℃贮存，有效期6个月。
 

附表 常用化疗药物临床使用剂量与血浆峰值浓度

ATP标准曲线（log-log）
  

样品检测结果举例
PERCENT TEST DRUG CONCENTRATION

EXCEL生成的原始数据